熱啟動(dòng)PCR常用于增強PCR擴增的特異性。熱啟動(dòng)PCR主要借助一種酶的修飾物（如抗體、親和配體、適體或化學(xué)修飾物）來(lái)抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結合能力降低，從而避免了非特異性擴增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動(dòng)技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應體系提供了極大的便利，而無(wú)需犧牲PCR反應的特異性。

當反應體系配制好后，在反應初始加熱步驟，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活（圖1）。激活時(shí)間和溫度根據DNA聚合酶及熱啟動(dòng)修飾物的不同而有所差別。對于某些聚合酶，激活和預變性合并成了一步。

圖1. 基于抗體熱啟動(dòng)技術(shù)的DNA聚合酶

降落PCR（Touchdown PCR）
另一種提升PCR反應特異性的方法是調整PCR循環(huán)的參數。在降落PCR儀中，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設定為比引物的高退火溫度（Tm）再高幾度[1,2]。較高的溫度有助于避免產(chǎn)生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復合物，因此可以減少不希望出現的擴增。就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產(chǎn)物，在PCR起始階段促進(jìn)特異性的擴增。

雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結合，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì )加劇引物與目標序列的分離，導致PCR的產(chǎn)量降低。為了克服這個(gè)問(wèn)題，在開(kāi)始的幾個(gè)循環(huán)中，退火溫度通常設置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以獲得足量的預期擴增子。當退火溫度降低到溫度時(shí)（通常比低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環(huán)都維持此退火溫度。通過(guò)這種方法，在PCR過(guò)程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì )出現非特異性的產(chǎn)物（圖2）。

圖2. 降落PCR。通過(guò)以較高的溫度起始，再隨著(zhù)循環(huán)逐漸降低到退火溫度（黑色曲線(xiàn)），這種PCR方法可提升反應特異性（黃色曲線(xiàn)）。目標擴增子的產(chǎn)量（綠色曲線(xiàn)）相應的得到富集。

巢式PCR（Nested PCR）

巢式PCR是常規PCR的一種演變，其增強了反應特異性和目標擴增子的產(chǎn)量。在此方法中，需要設計兩對引物：一對（外引物）在目標擴增區域的側翼，而另一對引物（巢式引物）對應于所擴增DNA的準確區域。輪PCR的產(chǎn)物之后作為第二輪PCR的模板（圖3）。圖3. 巢式PCR

如果對引物（外引物）由于引物錯配擴增出了非特異性產(chǎn)物，第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴增的概率極低，所以通過(guò)第二對引物的擴增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的另一個(gè)好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴增得到足量的產(chǎn)物。

快速PCR（Fast PCR）

在快速PCR中，通過(guò)縮減PCR步驟所需的時(shí)間來(lái)完成更快的擴增，而不影響擴增產(chǎn)量和效率?？焖傺h(huán)條件尤其適用于均有高擴增能力的DNA聚合酶，這種聚合酶在每次結合中可引入更多的核苷酸。高擴增能力的聚合酶可保持高擴增效率，而PCR延伸時(shí)間是Taq聚合酶（低擴增能力）延伸時(shí)間的1/2到1/3。通過(guò)將引物退火和延伸（如果溫度僅相差幾度）合并成一步，PCR反應時(shí)間可進(jìn)一步縮短。這個(gè)方案也被稱(chēng)為兩步PCR方案。
當使用低擴增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）擴增<500>

另一種快速PCR的調整方法為縮短變性時(shí)間，將溫度升高到98℃。使用這種策略需要注意的是，不是高度熱穩定的聚合酶在如此高溫下容易變性。
直接PCR（Direct PCR）
直接PCR意指直接從樣本中擴增目的DNA，而無(wú)需核酸純化。直接PCR中，在高溫變性階段，諸如細胞、組織等材料在*的緩沖液中裂解，釋放出DNA。因此這種方法簡(jiǎn)化了PCR實(shí)驗流程，減少了動(dòng)手操作的時(shí)間，同時(shí)可避免純化步驟中DNA的損失：常規PCR與直接PCR對比。

推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴增。細胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì )抑制PCR反應。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴增微量的DNA。

高GC含量PCR（GC-rich PCR）具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。高GC含量序列同時(shí)也涉及二級結構。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴增時(shí)卡住，從而影響了DNA的合成。

為了擴增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強GC相互作用，常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來(lái)幫助DNA變性，如DMSO。這些試劑通常會(huì )降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應的調整。

高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強結合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴增。高熱穩定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴增，因為更高的變性溫度（如98℃代替95℃）可促進(jìn)解鏈和PCR擴增。